Pewarnaan Spora
LAPORAN PRAKTIKUM "MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI"
A. Judul Praktikum
PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI
B. Tujuan Praktikum
Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.
C. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri.
2. Tinjauan Teori
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1999).
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral (Lay, 1994).
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Pelczar & Chan, 1986).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).
Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding Gram Positif mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung lipopolisakarida(Suriawiria, 1999).
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986)
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
D. Tinjauan Pustaka
Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil, yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup, dan logos= ilmu). Makhluk hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri berasal dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan kloroplas. Istilah “bakteria” telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5, meski ada jenis yang dapat mencapai 0,3mm. Meski umumnya memiliki dinding, seperti sel tumbuhan dan jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leewenhoek pada tahun 1674. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana el-sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan, 2003).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2009).
Memurut Pelezar and Chan, 2007 secra morfologi sel bakteri memnyai bagian-bagian sebagai berikut:
1. Kapsul : lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi kapsul adalah melindungi sel dari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sebagai sarana pengikat antar sel satu dengan yang lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat patogenitas dimana bakteri yang berkapsul biasanya bersifat patogen akan hilang/ berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul melindungi bakteri dari dari sistem imun tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh hospes, sistem imun tubuh tidak mampu lelawan bakteri.
2. Dinding sel : bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara kapsul dan membran sitoplasma dengan struktur sangat kaku. Tebal sel 10-35mm. Fungsi dindiing sel adalah pelindung sel dari tekanan osmosis, memberi bentuk pada sel, dan berperann dalam reproduksi.
3. Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel, fungsinya untuk mengatur zat-zat masuk dan keluar sel.
4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti filamen tetapi bukan flagela).Jumlah pili lebih banyak, lebih pendek, dan lebih kecil dari flagela.
5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat menembus dinding sel dan bermula dari dasar tubuh, merupakan suatu struktur granular yang tepat dibawah membran sel dalam sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu tubuh dasar, struktur seperti kait dan sehellai filamen panjang di luar dinding sel. Panjang flagel: beberapa kali panjang sel, namun diameternya lebih kecil daripada diameter ssel (10-20).
6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel anakan.
7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang), biasanya terdiri dari satu sel DNA yang sirkuler
8. Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom.
9. Ribosom : tempat sintesis protein.
E. Alat dan Bahan
1. Alat:
a. Pipet tetes
b. Kawat ose
c. Lampu bunsen
d. Mikroskop
e. Botol semprot
f. Cover Glass
g. Korek api
h. Object Glass
i. Kapas
j. Hair drier
2. Bahan:
1. Pewarna gram
a. Biakan murni
b. Garm A: Methylene blue
c. Gram B: Iodium
d. Gram C: Alkohol
e. Gram D: Safranin
f. Air
g. Minyak imersi
F. CARA KERJA
obyek glass difiksasi/diaseptiskan
satu ose biakan kuman murni (bacilus sp.) diletakkan di atas obyek glass
diratakan biakan kuman murni dengan jarum ose
difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2-3 kali dengan cepat
dituangkan pewarna carbol gentian violet, biarkan selama 1 menit
dibuang sisa carbol gentian violet, dicuci preparat dengan air mengalir
dikeringkan preparat dengan membiarkan di udara terbuka/ dihair drier
dituangkan pewarna iodium, biarkan selama 2 menit
dibuang sisa iodium
dicuci preparat dengan air mengalir
dikeringkan preparat diudara terbuka/ dihair drier
dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang
dibilas dengan air mengalir
dituangkan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/ pembanding biarkan selama 30 detik
dibuang kelebihan safranin
dicuci preparat dengan air mengalir
dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap
ditambahkan minyak imersi pada preparat dan amati preparat dibawah mikroskop dengan perbesaran lemah (10 X) kemudian perbesaran kuat (100)
G. Data dan Hasil
KELOMPOK | NAMA BAKTERI | TERMASUK WARNA | GAMBAR | |
GRAM (+) | GRAM (-) | |||
7 | Bacillus sp. | Ungu Berbentuk batang (basil) | |
H. Pembahasan
Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan morfologi pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif.
I. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .
J. Daftar Pustaka
Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual, Addison-
Wesley Publishing Company : New York.
Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect. Bandung.
gram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.
Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United
State of America.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
Gallery Laporan Praktikum Pewarnaan Gram
Bakteri Gram Positif Dan Negatif Ciri Contoh Perbedaan
Laporan Praktikum Mikrobiologi Akuakultur Kelompok Iv Mayor Ilmu
Search Teknologi Pangan Daging Islidedocs Com
Doc Laporan Praktikum Mikrobio Virologi Pewarnaan Bakteri
Laporan Praktikum Mikrobiologi Pewarnaan Gram Kel 9
Laporan Pewarnaan Sel Bakteri Finish
Laprak Modul Ii Pdf Mikrobiologi Air Il 2203 Pewarnaan
Laporan Mikrobiologi Teknik Pewarnaan Mikroorganisme
Pewarnaan Spor1 Pdf Document
Laporan Pewarnaan Gram Docx Docx Document
Makalah Pewarnaan Sederhana Negatif Kapsul Dan Gram
Laporan Praktikum Pengecatan Bakteri Laporanpraktikum Com
Junior Kelly Urergabar Tk
Sop Bakteri Gram Mqejeevk2yl5
Doc Pewarnaan Bakteri Secara Gram Bab Ii Praktikum Ke Iv
Search Laporan Praktikum Mikrobiologi Islidedocs Com
Laporan Praktikum Mikrobiologi Umum Pewarnaan Sel Bakteri
Plastic Action Network 2012
Laporan Tetap Praktikum Mikrobiologi Umum Oleh
Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Gram Negatif A Fine Docs
Comments
Post a Comment